Buch, Englisch, Band 63, 160 Seiten, Paperback, Format (B × H): 148 mm x 210 mm, Gewicht: 216 g
Reihe: Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik der Technischen Universität Braunschweig
Buch, Englisch, Band 63, 160 Seiten, Paperback, Format (B × H): 148 mm x 210 mm, Gewicht: 216 g
Reihe: Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik der Technischen Universität Braunschweig
ISBN: 978-3-95404-115-2
Verlag: Cuvillier
Antibodies and antibody fragments are most important tools for therapeutic and diagnostic
applications. An increasing demand of these high potential drugs makes less cost
intensive production systems most desirable. Compared to mammalian cell culture
microbial production platforms are beneficial with regards to reaching high production
titers, scale up approaches, regulatory aspects and reduced costs of goods. Amongst
these production systems those that are having the ability of an additional product
secretion are most advantageous as the downstream processing costs are decisively
reduced.
In this work Bacillus megaterium, as a Gram positive model organism, was used to
extensively study the production and secretion of the antibody fragment D.13 scFv. For
the bioprocess optimization a holistic approach was followed. First the aim was to
establish a high productive defined cultivation medium. Different media components like
carbon sources, metal ions and ammonium concentrations were screened throughout
various cultivation platforms ranging from micro titer plates to shaking flasks. Statistical
design of experiments and a genetic algorithm approach were used to establish an
appropriate defined high production medium. As a second step the process was transferred
to the bioreactor scale of several liter cultivation volume. An optimal bioprocess
strategy based on alternating growth and starvation phases was established to gain high
product titers of antibody fragment D1.3 scFv. As a final step an up-scale to a 100 L
bioreactor was done accounting for an advanced process control and considering “good
manufacturing practice” guidelines. The advanced bioprocess monitoring tool of flow
cytometry was used to gain deeper insights on microbial physiology at single cell level
regarding cell viability, cell integrity and production intensity. This knowledge was used for
a sophisticated cell physiology based bioprocess development and optimization. Furthermore
culture heterogeneities were measured and characterized for B. megaterium
producing antibody fragment D1.3 scFv under controlled bioreactor conditions. To obtain
additional information about the regulatory processes occurring inside the cell on gene
expression level a transcriptome analysis was performed comparing cells with an
increased production and secretion status to less producing and non-producing cells.
These cutting-edge technologies of flow cytometry and transcriptome analysis revealed
possible bottlenecks of the overall bioprocess’ performance and product secretion of
antibody fragments with B. megaterium as production platform and form a robust basis for
rational strain optimization and advanced process designs.
Antikörper und Antikörperfragmente sind wichtige Werkzeuge für eine große Anzahl von
diagnostischen und therapeutischen Anwendungen. Der stetig wachsende Bedarf dieser
hoch spezifischen Proteine macht kostengünstige Produktionsprozesse erstrebenswert.
Mikrobielle Produktionssysteme sind aufgrund von hohen Produktivitäten, Zulassungsaspekten
und geringeren Herstellungskosten vorteilhafter gegenüber industriell etablierten
Säugetier-Zellkulturen. In dieser Arbeit wurde die Produktion und Sekretion des Antikörperfragments
D1.3 scFv mit Hilfe des Gram positiven Modellorganismus Bacillus
megaterium intensiv untersucht. Bei der Bioprozessoptimierung wurde ein holistischer
systembiotechnologischer Ansatz verfolgt. Zunächst wurde ein definiertes Minimalmedium
mit erhöhten Produktionseigenschaften entwickelt. Verschiedene Mediumkomponenten,
wie die verwendete Kohlenstoffquelle, Metallionen- und Ammoniumkonzentration wurden
in unterschiedlichen Kultivierungsplattformen wie Mikrotiter-Platten und Schüttelkolben
optimiert. Dabei kamen Methoden der statistischen Versuchsplanung und die Verwendung
eines genetischen Algorithmus zum Einsatz. In einem zweiten Schritt wurde eine
Maßstabsvergrößerung des Kultivierungsvolumens in den Litermaßstab erfolgreich
vorgenommen. Dabei wurde eine für die Antikörperfragment-Produktion optimierte
Kultivierungsstrategie mit automatisierten alternierenden Wachstums- und Hungerphasen
entwickelt. In einem finalen Schritt wurde die Prozessstrategie auf den 100 l Maßstab
unter der Berücksichtigung von GMP-Richtlinien zur „guten Herstellungspraxis“ erfolgreich
übertragen. Prozessbegleitend wurde die Methode der Durchflusszytometrie verwendet,
um auf Einzelzellebene die Zellen hinsichtlich ihrer Aktivität bzw. Vitalität und ihres
Produktionsstatus zu charakterisieren. Diese Informationen wurden für eine auf der
mikrobiellen Physiologie basierenden ganzheitlichen Bioprozessentwicklung und
Optimierung erfolgreich angewendet. Darüber hinaus wurden Kulturheterogenitäten unter
kontrollierten Bioreaktorbedingungen gemessen und mit einem angepassten Clusterverfahren
ausführlich analysiert. Zusätzlich wurde eine Transkriptom-Analyse zur
Charakterisierung der Genexpression des Produktionsorganismus unter Produktionsbedingungen
sowie unter verstärkten Sekretionsbedingungen vergleichend zu Nicht-
Produktionsbedingungen durchgeführt. Basierend auf diesen innovativen Technologien
wurden die potentiellen kritischen Produktionsengpässe in der Produktion und Sekretion
von Antikörperfragmenten mit B. megaterium aufgedeckt. Diese Ergebnisse bilden eine
robuste Grundlage für eine weitere rationale Optimierung von Produktionsstämmen und
den zugehörigen Bioprozessen.
